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操作指南

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磁珠與微球應用(第3版)

背景概要:抗體、藥物、抗原、鏈霉親和素、地高辛、熒光分子、蛋白A、蛋白G、核酸DNA、核酸藥物、Oligo、重組蛋白等常常需要與磁珠偶聯,他們相互組合,功能多種多樣。下面進行簡單介紹。


磁珠產品之一:鏈霉親和素磁珠-用于大分子分離

1.磁珠本身特性                            

規格:10mg/ml;

磁珠大。280 nm1μm;結合力:20-25nmol 核酸或蛋白/mg。

儲存:2-8 °C保存。常溫運輸。

特性:磁珠均一、保證結果一致。

 2.鏈霉親和素磁珠

應用范圍:用于DNA、RNA、蛋白、細胞、細菌的分離;

特性:磁性分離,洗脫,濃縮,手動,自動均可;

捕獲方式:直接捕獲或間接捕獲均可;原理:生物素與鏈霉親和素特異性結合

3.具體應用:

1)特異性基因序列捕獲;(2)固化DNA/cDNA;(3)末端磁珠的單鏈核酸模板;(4)蛋白的純化;(5)特異性抗體標記磁珠后,細胞分離;(6)免疫方法的應用,如夾心法;

7)生物分子的篩選,核酸適配體,藥物篩選,噬菌體展示;

5.優越特性:

穩定溫和的2-8℃保存,室溫應用。實驗可以重復操作,保證結果良好。

 

鏈霉親和素磁珠詳解與步驟

1.親和素-磁珠,結合的是重組親和素蛋白,與生物素結合,結合效率較好。

2. 磁珠大。280 nm1μm;結合力:20-25nmol核酸或蛋白/mg。大于0.5mg蛋白/ml磁珠;

3.適用實驗:分離純化、IP、CO-IP、RNA pull down等;

4.保存:2-8℃,室溫運輸;

5.分別配有buffer A(核酸實驗)Buffer B(蛋白實驗)

6.磁力架可以贈送(采購滿1500元);

7.結合生物素化的核酸

1)輕輕震蕩磁珠,取100ul磁珠,靜置于磁力架,棄液體,Buffer A洗滌。

2)加入500ul-1ml生物素化的核酸,充分吹打或震蕩均勻,室溫反應30分鐘;

3)磁珠分離,丟棄液體。

4)計算磁珠結合核酸的量,根據前后濃度變化,乘以結合體積,計算所得到的核酸量。

8.結合生物素化的抗體或蛋白

1)震蕩磁珠,取出100uL,磁力架靜置1分鐘,丟棄上清;

2)加入1ml Buffer B,混均勻,再置于磁力架,洗滌一次,再加1mlBuffer B

3)加入生物素化的抗體或蛋白,體積控制在1ml內。

4)室溫混合反應磁珠和生物素化的蛋白或抗體;

5)磁性分離洗滌。如需要分離生物素抗體和親和素磁珠,加入0.1% SDS煮沸5分鐘。

6)如果實驗有背景,磁珠可以洗滌5次左右。

 

鏈霉親和素磁珠目錄

產品名稱

貨號

規格

價格

說明

SA-Beads-1

鏈霉親和素-1

007-1001

1ml, 10mg/ml

750

親水性或疏水性

尺寸:1μm

SA-Beads-1

鏈霉親和素-1

007-1002

2ml, 10mg/ml

1350

親水性或疏水性

尺寸:1μm

SA-Beads-1

鏈霉親和素-1

007-1005

5ml, 10mg/ml

3000

親水性或疏水性

尺寸:1μm

SA-Beads-28

鏈霉親和素-28

007-2801

1ml, 10mg/ml

850

親水性或疏水性

尺寸:2.8μm

SA-Beads-28

鏈霉親和素-28

007-2802

2ml, 10mg/ml

1450

親水性或疏水性

尺寸:2.8μm

SA-Beads-28

鏈霉親和素-1000

007-2805

5ml, 10mg/ml

3500

親水性或疏水性

尺寸:2.8μm

 

 

磁珠產品之二:Oligo(T)磁珠(純化RNA

1.產品特性

規格:5mg/ml; 大。200 nm,1μm;結合力:1-2 ug mRNA/mg。貨號:007-T

儲存:2-8 °C保存。冰塊運輸。

保存液:0.1 M Tris-HCl, 20 mM EDTA,含0.1%v/vTween-20,0.05%w/vNaN3。

2.Oligo(T)磁珠產品

Oligo (dT)25磁珠用總 RNA(動物組織、植物細胞、血液)快速分離出高純度且完整的mRNA。廣泛應用于各種實驗樣品中。磁珠上的 oligo-dT mRNA通過堿基互補雜交,經過步洗滌、洗脫和磁分離,即可獲得高純度的mRNA。

3.緩沖液

結合緩沖液:20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1.0 M LiCl, 2 mM EDTA.

裂解/結合緩沖液:100 mM Tris-HCl, pH 7.5, 500 mM LiCl, 10 mM EDTA, 1% LiDS, 5 mM dithiothreitol (DTT).

洗滌液A10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.15 M LiCl, 1 mM EDTA, 0.1% LiDS.

洗滌液B10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.15 M LiCl, 1 mM EDTA 10 mM Tris-HCl, pH 7.5.

四、實驗步驟

1. 磁珠預處理

1)將磁珠懸液漩渦振蕩30 s,使磁珠充分重懸;

2)取出100 μL磁珠懸液至1.5 mL 管中;磁珠分離,移去上清液;

3)加1mL結合緩沖液重懸磁珠,用緩慢吹打5次,磁分離,去上清。

4)加入100 μL結合緩沖液重懸磁珠。

2. 樣品與磁珠比例:

培養細胞(60mm皿)、血液、組織、尿液等50mg加入100μL磁珠。植物100mg加入100μL磁珠?RNA 100μg加入100μL磁珠。

3.操作步驟:

1)動物、血液、植物組織:將50mg-100mg植物或動物組織,在液氮中研磨并低溫保存,避免RNA降解。將樣品收集并轉移到新的EP管中,添加1mL裂解/結合緩沖液,勻漿器勻漿1-2min至裂解完全。該步驟盡可能快速操作,避免降解。 13,000rpm離心1 min,將上清液轉移至離心管(含有mRNA)。

2)細胞懸浮液

1×106的動物或植物細胞加1ml裂解/結合緩沖液。吹打均勻,裂解10分鐘。

再將DNA剪切。用2ml注射器通過反復吹打剪切溶液中的DNA,不影響mRNA質量。

室溫13,000rpm離心5min,將上清液轉移至離心管。用于mRNA純化或在-80℃備用。

4.純化提取mRNA

1)將裂解液與磁珠混合(混合比例如上),室溫下旋轉混合3-5分鐘。

2)磁分離,靜置2min,去上清。

3)室溫,用1ml洗滌液A1ml洗滌液B清洗磁珠,去除污染物或非特異性結合。

4)分別用1ml洗滌液A1ml洗滌液B清洗磁珠,去除可能的污染物。

5)從磁珠中洗脫mRNA:洗滌液B洗后,加入1020μl10mM Tris-HCl,75~80°C孵育2min,將含mRNA的上清轉移到新RNase-free的離心管。

5. Total RNA中純化mRNA 

1)取600-1000ng/ulRNA100ul100uL結合緩沖液混合。

265°C孵育2min,打開RNA二級結構,置于冰上。

3)將200 uL混合液與100 uL洗滌后,磁珠在室溫下旋轉混合3-5min。1mg磁珠大約吸附75μg的總RNA,磁珠應預先處理,分散在100 uL結合緩沖液中。

4)磁分離,靜置1-2min,去上清。

5)室溫下分別用200 uL洗滌液B清洗磁珠,磁珠分離去上清。重復該步驟1次。

6)加入20μl 10mM Tris-HCl,80°C孵育2min,將mRNA的上清液轉移到離心管。

磁珠產品之三:Protein A/G免疫沉淀磁珠

產品描述

Protein A/G免疫沉淀磁珠,利用Protein A/G包被在超順磁性磁珠表面,Protein A/G免疫沉淀磁珠表面具有更多的抗體結合位點。在IP實驗中被用到。用少量的磁珠,非特異性結合低,簡便。Protein A/G免疫沉淀磁珠具有大面積特異的表面區域,將強的抗體吸附和抗原結合?乖涂贵w的結合時間只需10-30分鐘,幫您快速完成完整IP實驗。Protein A/G免疫沉淀磁珠適用范圍比較廣廣泛,涵蓋了細胞裂解液、分泌液上清、血清、動物腹水、漱口水、眼淚等。

特性:

Protein A/GProtein AProtein G蛋白的IgG結合區重組融合蛋白,它包含 A的四個Fc結合區域及G的兩個Fc結合區域,分子量50kda。相比Protein A,Protein A/G的結合更少依賴pH值,但是卻具有了Protein AG兩者的加合效應。

產品參數和價格

濃度

5 mg/mL

規格   

1ml

磁珠大小

100 nm

IgG結合能力

0.4-0.5 mg/mL

配體

重組蛋白A/G

應用:

rProtein純化,免疫沉淀

pH穩定性:

7.5

運輸條件:

低溫運輸2-8℃。

儲存條件 :2-8°C儲存2年,避免反復凍融。

 

蛋白A/G免疫沉淀磁珠

貨號001.515   規格:1ml,2ml,3ml,5ml,10ml。儲存:4有效期:2

背景介紹:1Protein A是一種金黃色葡萄球菌的細胞壁表面蛋白,Protein G是鏈球菌屬的細胞表面蛋白,二者功能大致相同,主要與免疫球蛋白(Ig)的Fc區相互作用,結合大多數哺乳動物的IgG,兩者結合特異性上略有同。2Protein AProteinG免疫沉淀磁珠,是將Protein A/G通過化學鍵定向包被到超順磁性微球表面,有較好的抗體結合能力和低的蛋白非特異性吸附率,可從血清樣品中分離出純度>90%抗體。Protein A/G免疫磁珠共價偶聯蛋白A和蛋白G,比單獨蛋白A或者蛋白G結合更廣。3)蛋白A和蛋白G不僅維持其本身的Ig親和特性,也去除天然蛋白本身的非蛋白主要結合域以降低非特異性結合。4)應用于細胞裂解液、細胞分泌液上清、血清、動物腹水以及其它的免疫抗原等樣本。

產品性質:

Matrix spherical

磁性微球

配體(Ligand

重組ProteinA/G

結合能力(Binding Capacity

50µgIgG/mg

粒徑 (Particle size

1μm

磁珠濃度(Concentration

10mg/mL

儲存緩沖液(Storage Buffer

PBS,0.01% Tween-20, 0.02% NaN3e

應用(Application

rProtein Purification, Immunoprecipitation

使用方法

1. 緩沖液配制

平衡/結合/ 洗雜液:

0.15M NaCl, 20 mM Na2HPO4, pH 7.0

交聯液:

0.2 M 三乙醇胺, pH 8.2

中和緩沖液:

1M Tris-HCl,pH8.5

洗脫緩沖液:

0.1M 甘氨酸,pH 3.0

終止液:

50 mM Tris, pH 7.5

2. 抗原樣品制備

1血清樣品處理:若目標蛋白豐度較高,建議用結合緩沖液稀釋血清樣品至目標蛋白終濃度為10-100µg/mL,置于冰上備用(或置于-20℃長期保存)。

2)懸浮細胞樣品處理:離心收集細胞(4℃, 500g, 10min),棄上清后稱重,按每毫克細胞50µL的比例用1×PBS洗滌2次;按每毫克細胞5-10µL的比例加入結合緩沖液,同時加入蛋白酶抑制劑,混勻后置于冰上處理10min;離心收集上清液(4℃, 14000g, 10min),置于冰上備用(或置于-20℃長期保存)。

3)貼壁細胞樣品處理:去培養基,按每 1.0×105個細胞150µL的比例用1×PBS洗滌兩次;刮脫細胞,收集至1.5mL EP管內,按每 1.0×105個細胞20-30µL的比例加入結合緩沖液,同時加入蛋白酶抑制劑,混勻后置于冰上處理10min;離心收集上清液(4℃, 14000g, 10min),置于冰上備用(或置于-20℃長期保存)。

3)大腸桿菌樣品處理:離心大腸桿菌(4℃, 12000g, 2min), 棄上清稱重, 按每克(濕重)菌體10mL的比例用1×PBS洗滌2次;按每克(濕重)菌體5-10mL的比例加入結合緩沖液,同時加入蛋白酶抑制劑,重懸菌體,超聲裂解,離心收集上清(4℃, 17000g, 10min)。

3. 磁珠預處理:將磁珠漩渦振蕩1min,使其充分混懸;取25-50µL(相當于50-100µg)磁珠懸液置于1.5mL EP管中。加入200µL結合緩沖液洗滌,進行磁性分離,吸棄上清,重復1次。加入200 µL結合緩沖液重懸磁珠備用。

4. 抗體吸附

加入 100 μl平衡液將磁珠懸浮,加入目標抗體溶液,充分混勻。 室溫孵育 10min,可以振蕩或漩渦混合均勻。 置于磁分離器上,待磁珠吸附后,吸棄上清液。如需要可留做進一步檢測。 加500μl 洗雜液混均,置于磁架上待磁吸附后,棄上清。重洗至少 3次。

5. 抗體交聯 (備選)

1) 如果需要將抗體和目標抗原復合物共同洗脫,請忽略本步驟,直接進行操作 2.5。 50ul-1ml 磁珠量均可以按照以下步驟操作,無需額外增加交聯液體積。

2)加入 1ml 交聯液,振蕩懸浮,置于磁分離器上,大約1min,待溶液變澄清后,吸棄上 清液。該操作重復兩次。

3)再加入1ml 含有20 mM DMPdimetylpimelimidate dihydrochloride)的交聯液(需現用現配)。振蕩懸浮,在室溫下置于翻轉混合儀或者手工輕輕翻轉離心管, 促使溶液和磁珠充分接觸,約30min后,置于磁分離器上,大約 1min,待溶液變澄清 后,吸棄上清液。

4)用1ml終止液懸浮磁珠終止交聯反應,室溫下置于翻轉混合儀或者手工輕輕翻轉 離心管,促使溶液和磁珠充分接觸,約15min后,置于磁分離器上,大約 1min,待溶液變澄清后,吸棄上清液。

5)加 1ml平衡液,顛倒混勻,置于磁架,約 1min,溶液變澄清后,棄上清液。再重復兩次。

6. 抗原結合反應

1) 加入含有抗原的樣品(通常100-1000μL),用移液器輕輕吹打使抗原與磁珠-抗體復合物均勻分散。

2) 在室溫下置于翻轉混合儀或者手工輕輕翻轉離心管 10min,使抗原與抗體充分結合,如結合力較弱則可在室溫下反應1h或者在4℃下反應過夜。

3) 上述完成抗原吸附的磁珠-抗體-抗原復合物進行磁性分離,收集上清液,以備后續檢測。

4) 向離心管中加入1ml 洗雜液,用移液器輕輕吹打使磁珠-抗體-抗原復合物均勻分散,然后進行磁性分離,棄上清液;從磁分離器上取下離心管,再重復洗滌兩次。

7.抗原洗脫

A. 變性洗脫 此方法洗脫的樣品適用于SDS-PAGE檢測。

1) 從磁分離器上取下離心管,向其中加入25μl 1×SDS-PAGE Loading Buffer 混合均勻, 95℃加熱 5min。

2) 置于磁性分離器上,進行磁性分離,收集上清液進行SDS-PAGE檢測。

B. 非變性洗脫

1) 向磁珠-抗體-抗原復合物中加入50 μl 洗脫液,混合均勻,室溫孵育5min。

2) 置于磁性分離器上,進行磁性分離,收集洗脫液至新的 EP 管中。

3) 重復步驟 1)和2),收集洗脫液,與2)中洗脫液混合,加入中和液中和至 pH7.0-8.0。

 

磁珠產品之四:羧基磁珠偶聯核酸

1.原理簡介

羧基磁珠是常用的偶聯載體,本試劑盒提供用于羧基與氨基的偶聯所需的緩沖液,譬如羧基微珠偶聯抗體、氨基修飾DNA等。

 

2.試劑組成

緩沖液 體積    組成    注意

Coupling Buffer

(偶聯緩沖液) 50 ml   50 mM MES, pH 6.0, 0.01% Triton X-100

Coupling Agent

(偶聯試劑)    50mg×1     EDC;50 mg/ml×1ml (用前加入1ml Coupling Buffer     盡量現配現用,溶液,不超過1個月

    50mg×1     Sulfo-NHS;50 mg/ml×1ml (用前加入1ml Coupling Buffer 盡量現配現用,溶液,不超過1個月

Quench Buffer

(淬滅緩沖液) 50 ml   TBS (25 mM Tris-Cl, 130 mM NaCl, 2.7 mM KCl), pH 8, 0.01% Triton X-100;

Storage Buffer

(儲存緩沖液) 10 ml   TBS or PBS containing 0.01% Triton X-100 or 0.01% Tween 20, 0.05%NaN3.  

 

3.兩步偶聯

本方案通過加入穩定胺反應性中間體的sulfo-NHS來增加EDC介導的反應的效率。本方案中涉及的偶聯對象(蛋白、氨基修飾核酸、其它含伯氨基化合物)的使用量可根據需要進一步優化以達到最優偶聯率。

1. 確保蛋白或配體在無胺偶聯緩沖液。100μL偶聯緩沖液中需50400μg蛋白用于偶聯。

2. 渦旋振蕩重懸羧基磁珠。吸取100μL磁珠到1.5mLEP管中,磁分離并吸棄上清。

3. 加入200μL偶聯緩沖液。劇烈漩渦20秒,磁分離并吸棄上清。

4. 按步驟3再清洗羧基磁珠兩次。

5. 使用前用偶聯緩沖液配制EDC50 mg / mL)。使用前用偶聯緩沖液配制Sulfo-NHS50mg / mL)。

6. 向磁珠中加入60μL偶聯緩沖液、20μL新配的EDC溶液和20μL新配的Sulfo-NHS溶液;靹。

7. 室溫下混勻孵育15分鐘。磁分離并吸棄上清。

8. 200μL偶聯緩沖液清洗磁珠。渦旋混勻,磁分離并吸棄上清。

9. 加入100μL偶聯緩沖液和50400μg蛋白或配體。渦旋混勻。室溫下連續混合孵育0.54小時。

10. 將試管放入磁力架,磁分離吸棄上清。該上清液含未結合的配體,如優化方案可保存用于分析。

11. 向羧基磁珠加入250μL淬滅緩沖液。渦旋20秒,磁分離并吸棄上清。

12. 向羧基磁珠加入500μL淬滅緩沖液。室溫孵育3060分鐘。磁分離并吸棄上清。

13. 向羧基磁珠加入250μL淬滅緩沖液。劇烈漩渦20秒,磁分離并吸棄上清。

14. 從磁力架上取下EP管。加100μL存儲緩沖液;旌,并在28°C儲存偶聯好的磁珠。

 

 

貨號

名稱

規格

濃度

價格

200.001

OligoT-磁珠-生物素 10mg/ml

1ml

2-8

1150

200.002

OligoT-磁珠  10mg/ml

1ml

2-8

1150

200.015

磁珠-Goat Anti-Mouse IgGH+L Secondary Antibody

0.5mg

2-8

750

200.020

磁珠-Goat Anti-Rabbit IgGH+L Secondary Antibody

0.5mg

2-8

750

200.025

磁珠-Rabbit Anti-Goat IgGH+L Secondary Antibody

0.5mg

2-8

750

200.030

磁珠-Rabbit Anti-HumanIgGH+LSecondary Antibody

0.5mg

2-8

750

200.035

磁珠-Rabbit Anti-Rat IgGH+L Secondary Antibody

0.5mg

2-8

1000

200.040

鏈霉親和素磁珠 1mg/ml

10ml

2-8

1000

200.045

ProteinA/G磁珠 1mg/ml

10ml

2-8

1000

200.050

流式矯正熒光顆粒標準品

10mg

2-8

1000

備注:我公司提供的磁珠直徑均是1μM,如果特殊需要請聯系我們。

我們還可以提供其他大分子物質的磁珠標記。

 

磁珠標記服務

外顯子生物實驗室,提供大分子與磁珠標記的服務:

1、標記不同顆粒、粒徑的磁珠,如:300、500、1000、2800nm的磁珠;

2、可在磁珠上標記不同的大分子與小分子:

蛋白、抗體、寡合核酸、分子藥物、地高辛、生物素等;

3、可標記不同熒光或抗原:FITC、Cy3、Cy5、AMCA等;

4、標記方法涵蓋:疊氮化合物、炔類化合物、點擊化學反應、氨基反應等;

標記后的磁珠應用領域:

1)鏈霉親和素磁珠

用于生物素化核酸、生物素化抗體,其他生物素化配體和靶分子的分離和檢測,主要用于免疫檢測、免疫沉淀、細胞分選、純化等。

2)蛋白AG磁珠標記可用于抗體偶聯、蛋白偶聯、富集等。

3)可用于藥物篩選、蛋白質相互作用的研究、細胞間的相互作用。

磁珠標記客戶須知:

1)提供需要標記的樣品,如核酸、藥物、蛋白。我們也可以提供;

2)標記周期:3-4個工作日

3)收費:標記與純化費:500元每次,試劑另外收費

 

  抗體或核酸和熒光、生物素、地高辛表及服務

技術背景:

    在研究或生產中,常需要將核酸、蛋白、抗體、多肽、磁珠等進行標記,如標記熒光、生物素、地高辛、HRP等。后續應用于免疫化學、熒光原位雜交 、細胞示蹤、受體標記、細胞化學等,還可用于研究分子結構功能,定位及相互作用。

標記技術服務:

l  核酸探針標記修飾-熒光、生物素、地高辛、HRP、微(磁)珠;

l  抗體的標記修飾-熒光、生物素、地高辛、HRP、微(磁)珠;

l  蛋白的標記修飾-熒光、生物素、地高辛、HRP、微(磁)珠 ;

l  熒光包括FITC、Cy3、Cy5、Cy5.5等。

標記修飾位置和分子:                     

l  核酸探針:5’端 、3’端等

l  蛋白或多肽的N端 、C

l  原子點熒光

l  磁珠、納米、微球

l  生物素、凝集素

l  HRP、AP

標記和修飾服務說明:

1)客戶僅提供抗體、抗原、多肽、核酸等;

2)客戶選擇所標記物質:如熒光、生物素、地高辛等;

3)時間1-2周,價格500-1000/次,至少滿足10-20次實驗結果;

 

磁珠和寡核苷酸、引物、DNA核酸探針之間標記服務

一、標記磁珠的核酸探針、引物、核酸片段:

 貨號:C00X00  名稱:標記磁珠的核酸探針、磁珠引物  規格:1ml 儲存:2-8

1)磁珠標記核酸、探針、引物介紹:

l  基本原理:通過化學偶聯技術將磁珠和核酸探針、引物偶聯,提供磁珠標DNA核酸探針、寡核苷酸、引物、RNA等。

l  用途:特異性核酸分離、提取純化、核酸診斷、核酸富集、進一步研究核酸和蛋白的之間的作用、核酸和核酸的相互作用等。

2)核酸磁珠的特點:

Ø  客戶提供核酸探針序列,如oligo(T)等,也可根據客戶要求設計核酸探針,標記偶聯磁珠;

Ø  除了標記磁珠外,一直以來,我們還提供蛋白與核酸標記,包括各種熒光,生物素,地高辛技術服務。

3)提供的產品成份:

    ­1)磁珠標記的核酸探針 1ml,(2)結合、洗滌緩沖液等。

4)保存條件

Ø  所有試劑2-8℃保存;

Ø  試劑盒在有效期內的穩定;不要使用已經過期的試劑;

Ø  用前,將所有的試劑恢復至室溫(20-25℃),探針溶液必須混勻;

Ø  注意實驗安全,帶手套操作。

 

 

咨詢方式:

聯系電話:020-89895006             郵箱:focobio@126.com

微信或電話:180 1199 7127              QQ1050304988

網站: www.natashasnotary.com  www.focobio.com

地址:廣州市海珠區敦和路189號留學人員創業基地2號樓404-405





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