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操作指南

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mRNA FISH 實驗案例(12)-Xist 原位雜交與免疫熒光共定位
作者:Exonlab 發布于:2022/9/28 18:58:30 點擊量:

1. Xist探針準備

1)在 Xist 序列獲得寡核苷酸探針(20-40 核苷酸長度的寡核苷酸,Tm=63-65ºC,標記多個地高辛或熒光素),探針最終濃度約為12-25μM。亦可聯系我們制備和購買探針,贈送內參。

2)用雜交液將熒光或地高辛標記的探針稀釋至終濃度為 250 nM 。雜交液配制:10%去離子甲酰胺,300mM NaCl;30mM檸檬酸鈉;1mg/ml牛血清白蛋白;10% DSS。亦可聯系我們購買。

2.制備石蠟組織切片或培養細胞:

石蠟組織切片:詳見石蠟組織切片mRNA原位雜交,類似于普通免疫組化切片。培養細胞:移去 6 孔培養皿中培養基。用 PBS清洗,吸出,在培養皿中加入 0.5ml 胰蛋白酶,孵育5-10分鐘。加入5 ml 培養基,打數分散細胞。將細胞轉移到 10ml 管中,在室溫下以 1500 rpm 離心5 分鐘。棄去培養基,懸浮細胞于1-2 ml PBS中,細胞備用,福爾馬林或無水乙醇固定10分鐘。用細胞對切片進行涂片或用設備甩片,37℃晾干,過夜。

3. 免疫熒光

1)將載玻片放入裝有 PBSTT1x PBS 0.1% Tween-20,0.1% Triton-100)的染色盒或染色缸內中10分鐘。(2) 將載玻片傾斜放置,移去液體,滴加100 μl 封閉溶液(1x PBS、1% BSA、0.1% Tween-20),覆蓋玻片,在室溫下孵育 10 分鐘。(3)取下蓋玻片,倒去封閉液,加入 40-100μl 稀釋抗體(濃度為 1:500, 熒光抗體),注意避光。蓋好蓋玻片,室溫避光孵育30分鐘。

3. 原位雜交

1)將載玻片傾斜,抗體緩沖液順玻片流下。在載玻片上加入 500 μl FISH 洗滌緩沖液(2x SSC+10% 甲酰胺),室溫孵育5分鐘。

2)傾斜玻片,去除 FISH 洗滌液,載玻片上加入20μl 寡核苷酸探針,蓋上蓋玻片,然后將載玻片轉移到預熱的濕盒內;在37°C孵育 2-24 小時。

3)玻片盒內加入 FISH 洗滌液,將洗滌液預熱(如37°C水。,FISH 洗滌緩沖液。載玻片孵育5分鐘,期間,蓋玻片從載玻片上脫落。

4)更換洗滌液,將載玻片洗滌緩沖液中繼續孵育 5 分鐘。

5)將載玻片滴加 0.5 ng/ml 含抗淬滅劑DAPI溶液(我公司有售)。

6)用指甲油或甘油封片,熒光顯微鏡下觀察、拍照。4°C避光中保存幾個月。




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